Определение нуклеозидфосфатов методом тонкослойной хроматографии
Оборудование и реактивы: СФ; хроматоскоп; весы; рефрижераторная центрифуга; камера для тонкослойной хроматографии; пластинки Silufol uv 254; ножницы; фарфоровые ступки; пробирки; микропипетки; градуированные пипетки на 1 и 2 мл; мерный цилиндр на 100 мл; препаровальная игла. Пропанол; 25%-ный раствор аммиака; жидкий азот; 5%-ный раствор ТХУ кислоты; 0,1 н. HCl; стандартные 0,01 М растворы АТФ, АДФ, АМФ.
Материалы: проростки; ткани животных.
Ход работы
Навеску (0,5 – 1 г) растительной или животной ткани измельчают ножницами на холоду, заливают жидким азотом и растирают в ступке. Затем к растертому порошку приливают 1 мл 5%-ной ТХУ кислоты, перемешивают и центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин при 0 - 4° С. Надосадочную жидкость сливают в пробирку, к осадку приливают еще 1 мл 5%-ной ТХУ кислоты, перемешивают и центрифугируют. Супернатанты объединяют и используют для хроматографии. На пластинки Silufol uv 254 в нижней части, отступив 2 см, наносят в виде полосы 0,03 – 0,05 мл насадочной жидкости. После подсыхания ставят в сосуд для восходящей хроматографии. В качестве растворителя используют систему н-пропанол – 25%-ный аммиак – вода (60 : 30 : 10). Время разделения около 2 ч. Затем вынимают хроматографические пластинки, высушивают на воздухе и просматривают в хроматоскопе (светофильтр УФС-1).
Нуклеотиды располагаются в порядке снизу вверх: АТФ, АДФ, АМФ. Зоны, в которых обнаруживаются нуклеотиды, обводят препаровальной иглой, соскабливают в пробирки и экстрагируют 1,8 мл 0,1 н. HCl, интенсивно встряхивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость фотометрируют в кювете шириной 3 мм при длине волны 257 нм против контроля. Контролем служит соскобленный с пластинки сорбент из золы, не содержащий нуклеотидов; с ним поступают в дальнейшем так же, как с золами, в которых обнаружены нуклеотиды.
Содержание нуклеотидов рассчитывают по калибровочным графикам, составленным для каждого нуклеотида по формуле
C=
где D – оптическая плотность; В – общий объем экстракта, мл; К – коэффициент экстинкции (равный для АТФ, АДФ, АМФ соответственно 14,6 10
, 15,0 10, 14,7 10); А – объем нанесенного экстракта, мл; n – навеска, г.
Заключение
В результате выполненной курсовой работы можно сделать вывод, что структурными блоками гигантских молекул нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Каждый нуклеотид содержит три различных компонента: азотистое (пуриновое или пиримидиновое) основание, моносахарид пентозу (рибозу или дезоксирибозу), остаток фосфорной кислоты. Эти компоненты соединены друг с другом в такой последовательности: азотистое основание пентоза — фосфат. Соседние нуклеотиды соединены друг с другом посредством эфирной связи между моносахаридом и фосфатом другого нуклеотида.
Гидролиз нуклеиновых кислот, выделенных из ядер клеток, показал, что они состоят из пуриновых и пиримидиновых оснований (аденина, гуанина, цитозина, тимина), дезоксирибозы и фосфорной кислоты. Эта кислота была названа дезоксирибонуклеиновой (ДНК). Из дрожжей была получена другая нуклеиновая кислота, содержащая вместо дезоксирибозы рибозу. Ее назвали рибонуклеиновой кислотой (РНК). В нее входят основания — аденин, урацил, цитозин и гуанин. ДНК и РНК ответственны за хранение, репликацию (воспроизведение), транскрипцию (перенос) и трансляцию (передачу) генетической (наследственной) информации.