Выделение суммарных белков
Для выделения всех белковых веществ использовали щелочные растворы, в которых большинство белков довольно хорошо растворяются.
Для извлечения белков из свежего растительного материала навеску листьев, стеблей промораживали в холодильнике (1 сутки). Затем измельчали в гомогенизаторе или растирали с четырехкратным (по массе) количеством буфера (рН=10,0). Гомогенат промораживали в холодильнике, и, после оттаивания, встряхивали на механической мешалке в течение 1-2 часов, затем центрифугировали в течение 5-10 минут при 3000 об/мин. Жидкость над осадком сливали, а остатки клеток вновь гомогенизировали или растирали в ступке с прокаленным песком. Затем гомогенат снова встряхивали с буферным раствором в течение 20-30 минут и опять центрифугировали. Такую экстракцию проводили 5-6 раз. Общий объем экстракта доводили буферным раствором до 25 мл [7].
Боратный буфер (рН=10,0):
Раствор 5: NaOH 0,1Н
Раствор 8: тетроборат Na 0,05М (12,367 г Н3ВО3 + 100 мл 1Н раствора NaOH в 1 л).41 мл раствора 5 доводили до 100 мл раствором 8.
Определение содержания белка по биуретовой реакции [10].
Биуретовый реактив: растворяли в 250 мл воды 0,75 г CuSO4·5H2O и 3 г виннокислого натрия-калия (NaKC4H4O6·4H2O), затем при энергичном помешивании добавляли 150 мл 10 % -го раствора NaOH, свободного от Na2CO3, и 1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления; объем раствора довели водой до 1 л.
К 1мл исследуемого раствора, содержащего 1-10 мг белка, прибавляли 4 мл биуретового реактива, перемешивали и оставляли стоять 30 минут при комнатной температуре. По истечении времени колориметрировали при λ=540 нм против воды. Содержание белка рассчитывали по калибровочной кривой, составленной для альбумина: в серию пробирок вливали 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мл 1 % -го водного раствора яичного альбумина, содержащего от 1 до 10 мг белка, доводили объем раствора дистиллированной водой до 1 мл, перемешивали, добавляли в каждую пробирку по 4 мл биуретового реактива, перемешивали и через 30 минут колориметрировали.