Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
Определение активности фермента проводили согласно методике, предложенной Корнбергом [49].
Определение единицы активности: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37o С. Удельная активность ДНК-полимеразы выражается в единицах на миллиграмм фермента.
Реакционная смесь содержала: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА, 0,033мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP), 10 μСi [α -P32] dTTP или dATP денатурированную ДНК спермы лосося или активированную ДНК тимуса теленка.
Буфер для разведения фермента: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА.
В пробы для измерения активности (объем 50 мкл) вносится 1мкл фермента из различных разведений. В качестве контроля берется проба без добавления фермента (фоновое включение dNTP в отсутствии ДНК-полимеразы). Инкубация 30 мин при 37o С. Далее следует 2 варианта:
Вариант 1: Пробы наносятся на ДЕАЕ-бумагу, которая затем промывается 3 раза в 0,5 М Na2HPO4 (pH 7,0) [50]. Бумагу можно оставить влажной до измерения количества импульсов.
Вариант 2: Образцы наносятся на фильтр GFC (Whatman). Фильтры высушиваются и промываются 3 раза по 2 мин в 200 мл раствора 200 мМ Na4P2O7, 5% ТХУ(охлажденной на льду), после чего промываются 70% этанолом и высушиваются [50].
Измеряется радиоактивный фон среды (количество импульсов), затем измеряется количество импульсов, которое дает каждая проба. В качестве контроля - проба не инкубированная и не содержащая фермент (измеряется количество импульсов, которое дает сама метка). Вычисляется процент включения dNTP от суммарной метки в реакции. Отсюда можно выяснить количество dNTP, включившихся за время инкубации (нам известно количество dNTP в реакционной смеси) и активность полимеразы.
3. Результаты и их обсуждение