Выделение Tth ДНК-полимеразы
Выделение Tth-полимеразы проводилось согласно методике выделения Taq-полимеразы [9].
Культуру клеток E. coli BL21(DE3) с рекомбинантной плазмидой, несущей ген Tth ДНК-полимеразы, выращивали в жидкой среде LB при 37o C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,57. Добавляли ИПТГ до конечной концентрации 40 мкг/мл. Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -20o С.
Для разрушения клеток 3г клеточной биомассы ресуспендировали в 30 мл буфера для выделения (50 мМ Трис НCl рН 7,5, 1мМ ЭДТА, 1,25 мМ PMSF, 2 мг/мл лизоцима). После инкубации в течение 15 минут при 20o С клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (2 мин. "озвучивание", 1 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Для денатурации белков с нуклеиновых кислот к лизату при постоянном помешивании и 4o С добавляли по каплям сульфат аммония до концентрации 0,2М.
Суспензию разрушенных клеток центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин на центрифуге Beckman LS-75 (ротор T35, Beckman, США). Для денатурации белков E. coli супернатант прогревали при 75o С в течение 30 минут. Затем к раствору при постоянном помешивании добавили полиимин Р до концентрации 0,6% при 4o С. Раствор инкубировали 2 часа на льду, а затем центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин. Супернатант был нанесен на колонку с фенил-сефарозой объемом 6 мл, уравновешенную буфером А(50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА), содержащим 0,2 М сульфат аммония. Промыли колонку буфером А, содержащим 20% глицерин (wt/vol). Элюцию связавшихся белков проводили 100 мл линейного градиента концентрации мочевины (0-4М) на буфере А со скоростью 10мл/час. Собирали фракции по 5 мл. Оптический профиль элюции определяли по поглощению при 280 нм в проточном спектрофотометре UV-1 ("Pharmacia", Швеция). Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединяли и диализовали в течение ночи против буфера Б (100мМ KCl, 50мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1мМ ЭДТА, 0,2% Tween20). Диализованный препарат наносили на колонку с гепарин-сефарозой, уравновешенную буфером Б. Элюцию вели 60 мл градиента 100-700 мМ KCl в буфере Б со скоростью 10 мл/час. Фракции собирали по 3 мл. Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединили и диализовали против буфера для хранения (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 100мМ KCl, 0,1мМ ЭДТА, 1мМ дитиотрейтол, 0,2% Tween20, 50% глицерин). Диализованный препарат хранили при -20o С.