Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4
Культуру клеток E. coli BL21(DE3) выращивали в жидкой среде LB при 37o C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,68. Добавляли ИПТГ (40мг/мл) до конечной концентрации 40 мкг/мл.
Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -200С.
Для разрушения клеток 6г биомассы (полученной из 2 литров культуры) ресуспендировали в 80 мл Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9 ). Далее клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (40 сек "озвучивание", 2 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Суспензию разрушенных клеток цен.трифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Супернатант пропустили через крупнопористый стеклянный фильтр (для устранения грубых загрязнений), нанесли на колонку с Ni2+-NTA-агарозой, промытую водой (3 объема колонки), 50mM NiSO4 (5 объемов), Binding-буфером (3 объема). После нанесения образца колонку промыли 10 объемами Binding-буфера, а затем 6 объемами Wash-буфера (60мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9) и 6 объемами Elute-буфера (1М имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9). Фракции, содержащие фермент, объединили, измерили концентрацию полинуклеотидкиназы (по поглощению при длине волны 280 нм). Рассчет коэффициента экстинции проводили по формуле ε280= (NTrp*5,500 + NTyr*1,490 + NCys*0,125)/Mr, согласно [48]. В рассчет брались только Cys свободные, не участвующие в образовании дисульфидных связей.