Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4
Клонирование гена Т4 ДНК-полимеразы проводили в два этапа, так как сайт для эндонуклеазы XhoI находится внутри последовательности гена и в праймере к 3/-концу гена. Клонирование 5/-концевого фрагмента описано выше.
Анализ клонов проводился обработкой плазмидной ДНК рестриктазами XhoI и SphI. Отщепленный фрагмент свидетельствовал о присутствии клонированного N-конца гена Т4 ДНК-полимеразы (рис 5) в плазмидах четырех клонов.
Клонирование 3'-концевого фрагмента гена 43. Расщепляли полученную плазмиду, содержащую 5'-концевую последовательность гена рестриктазой XhoI. Проводили лигирование со вставкой аналогично предыдущей реакции лигирования.
Трансформировали клетки BL21(DE3), приготовленные кальциевым методом[13].
Анализ клонов проводили обработкой плазмидной ДНК рестриктазой XhoI. В качестве контроля служила ДНК рЕТ21-d с клонированным 5'-концом гена 43 (плазмида pET43N). Было отобрано 2 клона (2 и 9), в которых видна была вставка большого фрагмента. Для определения ориентации большего фрагмента гена 43 (3'-конца) производили гидролиз рестриктазами NsiI и BspLu11II (изошизомер эндонуклеазы XbaI). О результате расщепления судили по электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Полоса, соответствующая 2072 парам оснований, свидетельствовала о правильной ориентации лигированного фрагмента в обоих клонах (рис. 5).