Анализ клонов
Анализ клонов проводили рестрикцией плазмидной ДНК или с помощью метода ПЦР с колоний.
Мини-препаративное получение плазмидной ДНК.
Клетки, содержащие плазмидную ДНК, выращивали в 2 мл LB-среды до поздней логарифмической фазы роста. Клетки центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин в центрифуге Eppendorf (Eppendorf, США). Клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора 1 () содержащем РНКазуI (10 мкг/мл) и лизоцим (7мг/мл), инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Добавили 200 мкл раствора 2 (0,2 н NaOH, 1% SDS). Инкубировали 15 мин. Пробирки переносили в лед и добавляли 150 мкл 3 М ацетат Na. Оставили на льду на 15 мин, затем центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант переносили в пробирку и переосаждали этанолом. ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в буфере ТЕ.
ПЦР с колоний.
Отдельные колонии ресуспендируются в 30 мкл ТЕ-буфера, образцы кипятятся 5 минут и центрифугируются 3 мин при 3000 об/мин. В супернатанте находится плазмидная ДНК. В отдельные пробы с15 мкл реакционной смеси для ПЦР добавляется по 5 мкл раствора плазмидной ДНК. Проводится ПЦР с использованием одного универсального праймера, комплементарного, например, Т7 терминатору вектора pET-21d (или pET-28b), и праймера, комплементарного 5/-концу фрагмента. Такой подход используется для избежания фальшивого позитивного результата при выполнении данной процедуры и заодно сразу подтверждается правильная ориентация фрагмента в векторе [47].