Трансформация клеток E. Сoli

Трансформацию проводили кальциевым методом и методом электропорации.

Подготовка компетентных клеток для электротрансформации. Петлей с косяка засевали "ночную культуру" E.coli BL21(DE3)pLysS в пробирку с 5 мл LB-среды и инкубировали ночь на качалке при 37oС. В колбу со 100 мл LB-среды вносили 1 мл ночной культуры и растили при 37o с хорошей аэрацией до плотности 0.5-1 ОЕ при 590 нм. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 15 мин в предварительно охлажденных стаканах. Следующие операции проводили в ледяной бане. Осажденные клетки дважды промывали холодным раствором для промывки клеток (1 mM HEPES pH 7.0) и два раза 10%-ным глицерином. Ресуспендировали клетки в 200-300 мкл 10%-ного глицерина. Полученные компетентные клетки хранили при -70oС, расфасованными аликвотами по 70 мкл.

Электротрансформация. Электрокомпетентные клетки размораживали при комнатной температуре и помещали на лед. К суспензии клеток добавляли 1 мкл раствора ДНК (из лигазной реакции) , смесь выдерживали во льду более 1 мин. В предварительно охлажденные ячейки помещали 70 мкл суспензии и обрабатывали одиночным высоковольтным импульсом (1700 В). Сразу после обработки в ячейку добавляли 1 мл SOC-среды, клетки переносили в пробирки и инкубировали 1 час при 37oС для экспрессии генов антибиотик резистентности. После этого производили высев на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующие антибиотиками. Клетки инкубировали ночь при 37oС.

Приготовление клеток кальциевым методом и трансформация

Подращивали культуру клеток до оптической плотности 0,3. Поместили клетки в большие пробирки "Эппендорф", центрифугировали 2 мин при 3000 об/мин. LB-среду слили, добавили 500 мкл 100 mM CaCl2. Центрифугировали в течение 2 мин при 3000 об/мин. К осадку добавили 100 мкл буфера К, клетки ресуспендировали, оставили на 30 мин при 0oС. Затем добавили ДНК ( 30 нг вектора из лигазной реакции). Оставили еще на 30 мин при 0oС, после чего перенесли клетки на 2 мин в баню на 42oС . Затем образцы опять перенесли в ледяную баню, инкубировали 5-7 мин. Добавили 500 мкл LB-среды, инкубировали 1 час при 37o С и хорошей аэрации.

На чашки с LB агаром, содержащим соответствующий антибиотик, высевали 300 мкл клеток. Инкубировали ночь при 37oС.