Лигирование
Реакционная смесь (для случая с Т4 ДНК-полимеразой): ДНК-вставка 10 мкл (400 нг), ДНК-вектор 20 мкл (200 нг), 10х лигазный буфер 4 мкл, АТФ 10 mM- 4 мкл, ДТТ 200mM 1 мкл, Т4 ДНК-лигаза 1 мкл. Инкубация 16 часов при комнатной температуре.
В качестве контроля проводили лигазную реакцию с плазмидной ДНК (pMTL: XbaI ) без вставки. Инактивировали ДНК-лигазу прогревом при 65o 15 мин. Эффективность лигирования оценивали по электрофорезу (переход линейной формы плазмидной ДНК в кольцевую).
Лигирование молекул вектора и фрагмента (с геном полинуклеотидкиназы фага Т4) проводилось в 20 мкл реакционной смеси, содержащей: 2 мкл lig- буфера, 2 мкл 10 мМ АТФ, 2мкл 50мМ ДТТ, 6 мкл (190 нг) pET-28b:NcoI:XhoI , 8 мкл (40нг) ДНК-вставки, 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Пробу инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем лигазу инактивировали прогреванием 20 мин при 75o С.