Подготовка фрагментов ДНК
Фрагмент ДНК, содержащий ген Т4 ДНК-полимеразы, полученный с помощью ПЦР, обрабатывали рестриктазами XhoI и BspIS4I [15], сайты для которых были заложены в синтезированных олигонуклеотидах. Сначала проводили рестрикцию с XhoI (при 37o C), т.к. эта рестриктаза инактивируется прогреванием при 65o C 20 минут. Для рестриктазы XhoI есть сайт в олигонуклеотиде 2F2 (к 3'-области гена) и внутри последовательности гена Т4 ДНК полимеразы , по этому делали полный гидролиз. В результате было получено два фрагмента : 2500 (3'-конец гена 43) и 196 пар оснований (5'-конец гена 43). После инактивации XhoI в ту же смесь добавили рестриктазу BspIS4I, для которой был заложен сайт в праймере к 5'-области гена. Инкубировали 30 мин при 48o C, инактивировали фермент добавлением ЭДТА (до конечной концентрации 10mM). Экстрагировали фенолом и смесью фенол:хлороформ (1:1) [46].
Перед экстрацкией к образцу добавляли раствор т-РНК (в качестве соосадителя) до конечной концентрации 20мкг/мл. ДНК осадили этанолом и растворили в 50 мкл ТЕ. Таким образом в растворе присутствовали фрагменты гена Т4 ДНК-полимеразы длиной 2500 и 196 п. о.
Фрагменты ДНК, содержащие гены РНК-лигазы и Tth-полимеразы обрабатывались эндонуклеазой Bli736I, сайты для которой находятся в праймерах к 5/-концу гена, и XhoI, EcoRI (сайты для которых заложены в праймерах к 3/-концу генов), соответственно. Фрагмент, содержащий ген полинуклеотидкиназы, обрабатывался эндонуклеазами PaqI (5/-конец) и XhoI.