Подготовка вектора
Использовали плазмиды pET-21d и pET-28b, в полилинкере которых есть сайты для рестриктаз NcoI, XhoI и EcoRI. Для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4 использовали вектор pET-21d, обработанный эндонуклеазами NcoI и XhoI. Ген Т4 полинуклеотидкиназы клонировали в pET-28b, обработанную теми же эндонуклеазами. Для клонирования гена Tth-полимеразы использовали плазмиду pET-21d, обработанную рестриктазами NcoI и EcoRI. Расщепление проводили одновременно в двух пробах с разными рестриктазами для того, чтобы можно было проследить за полнотой гидролиза ДНК каждым ферментом. Для расщепления вектора внесли 12 мкл (7мкг) ДНК pET-21d (pET-28b), 12 мкл десятикратного буфера для рестрикции (МRB), добавили воды до объема смеси 120 мкл. Из этой смеси отобрали 20 мкл (как контроль), оставшееся количество поделили пополам (по 50 мкл). В одну пробу добавили рестриктазу XhoI (EcoRI), в другую- NcoI. Инкубировали при 37o C 3 часа. Проводили инактивацию ферментов прогреванием при 65o C 20 мин. Полноту гидролиза оценивали по электрофорезу. После полного расщепления вектора первыми рестриктазами, к смеси добавляли вторые рестриктазы (к образцу с плазмидой, расщепленной по сайту XhoI (EcoRI), добавляли NcoI, и наоборот), инкубировали образцы при 37oC 3 часа. Инактивировали ферменты добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 mM. Очистку ДНК вектора проводили с помощью выделения из геля (легкоплавкая агароза) по методике, описанной выше.