Амплификация последовательностей генов
Для амплификации фрагмента, содержащего последовательность гена 43, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 20 мкл реакционной смеси.
Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:
F1(к 5'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'
F2(к 3'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'
Реакционная смесь содержала: 11,9 мкл Н2О, 2мкл 10x Taq-буфера, олигонуклеотидов-праймеров по 20 пмоль каждого, 2 нг ДНК фага Т4, 0,4 мкл раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (конечная концентрация каждого dNTP в реакционной смеси 200мкM), 1 мкл смеси полимераз (Taq и Pfu ).
Был подобран оптимальный температурный режим, составлена программа для прибора (Termal cycler ).
) Денатурация 950 3 мин
) Денатурация 950 30 сек
) Отжиг праймеров 340 30 сек
) Элонгация 720 3 мин
) Повторение цикла (пункты 2-4) 3 раза
) денатурация 950 30 сек
) отжиг праймеров 600 30 сек
) элонгация 720 3 мин
) повторение цикла(пункты 6-8) 20 раз
) финальная элонгация 720 5 мин
Температура отжига рассчитывалась для комплементарной части и для полной последовательности олигонуклеотида по формуле: Тm= 20( А-Т )+40( G-C ).
Использовали при проведении ПЦР смесь полимераз Taq+Pfu для точного и быстрого синтеза комплементарных цепей ДНК. Время элонгации вычислялось исходя из скорости работы Taq- и Pfu-полимераз. Taq-полимераза достраивает примерно 1000 оснований за минуту, Pfu- тоже самое выполняет примерно за 2 минуты. Так как основной синтез выполняет Taq-полимераза, то рассчет времени элонгации вели исходя из величины амплифицируемого фрагмента ( 2696 пар оснований) и скорости синтеза ДНК, равной 1000 оснований в минуту.
Амплификация последовательности гена полинуклеотидкиназы фага Т4
Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:
С8 (к 5'-области гена) 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG'
С5 (к 3'-области гена) 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'
Программа:
) Денатурация 95o 5 мин
) Денатурация 95o 30 сек
) Отжиг праймеров 51o 30 сек
) Элонгация 72o 2 мин
) Повторение цикла (пункты 2-4) 25 раз
) финальная элонгация 72o 4 мин
Амплификация последовательности гена РНК-лигазы фага Т4
Олигонуклеотиды:
В11(к 5'-области гена)5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'
B12(к 3'-области гена) 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'
Температурный режим:
) Денатурация 95o 5 мин
) Денатурация 95o 30 сек
) Отжиг праймеров 55o 30 сек
) Элонгация 72o 2 мин 20 сек
) Повторение цикла (пункты 2-4) 24 раза
) финальная элонгация 72o 4 мин.
Амплификация последовательности гена Тth-полимеразы
Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:
А9 (к 5/-концу ) 5/- GCCGGTCTCCCATG
GAGGCGATGCTTCCG-3/
А8 (к 3/-концу) 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/
Программа:
) Денатурация 95o 5 мин.
) Денатурация 95o 30 сек.
) Отжиг праймеров 75o 30 сек.
) Элонгация 72o 2 мин 40 ceк.
) повторение цикла (пункты 6-8) 34 раза
) финальная элонгация 72o 4 мин.
клонирование эндонуклеаз рестрикция фаг