• Главная
  • Карта сайта

Биология и природа вокруг нас ...

Главное меню

  • На главную
  • Гидросфера и атмосфера Земли
  • Функциональная асимметрия мозга
  • Строение клеток растений
  • Анатомия человека
  • Человек как биологический вид
  • Процесс антропогенеза
  • Естествознание в системе наук

Амплификация последовательностей генов

Для амплификации фрагмента, содержащего последовательность гена 43, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 20 мкл реакционной смеси.

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:

F1(к 5'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

F2(к 3'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

Реакционная смесь содержала: 11,9 мкл Н2О, 2мкл 10x Taq-буфера, олигонуклеотидов-праймеров по 20 пмоль каждого, 2 нг ДНК фага Т4, 0,4 мкл раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (конечная концентрация каждого dNTP в реакционной смеси 200мкM), 1 мкл смеси полимераз (Taq и Pfu ).

Был подобран оптимальный температурный режим, составлена программа для прибора (Termal cycler ).

) Денатурация 950 3 мин

) Денатурация 950 30 сек

) Отжиг праймеров 340 30 сек

) Элонгация 720 3 мин

) Повторение цикла (пункты 2-4) 3 раза

) денатурация 950 30 сек

) отжиг праймеров 600 30 сек

) элонгация 720 3 мин

) повторение цикла(пункты 6-8) 20 раз

) финальная элонгация 720 5 мин

Температура отжига рассчитывалась для комплементарной части и для полной последовательности олигонуклеотида по формуле: Тm= 20( А-Т )+40( G-C ).

Использовали при проведении ПЦР смесь полимераз Taq+Pfu для точного и быстрого синтеза комплементарных цепей ДНК. Время элонгации вычислялось исходя из скорости работы Taq- и Pfu-полимераз. Taq-полимераза достраивает примерно 1000 оснований за минуту, Pfu- тоже самое выполняет примерно за 2 минуты. Так как основной синтез выполняет Taq-полимераза, то рассчет времени элонгации вели исходя из величины амплифицируемого фрагмента ( 2696 пар оснований) и скорости синтеза ДНК, равной 1000 оснований в минуту.

Амплификация последовательности гена полинуклеотидкиназы фага Т4

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:

С8 (к 5'-области гена) 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG'

С5 (к 3'-области гена) 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'

Программа:

) Денатурация 95o 5 мин

) Денатурация 95o 30 сек

) Отжиг праймеров 51o 30 сек

) Элонгация 72o 2 мин

) Повторение цикла (пункты 2-4) 25 раз

) финальная элонгация 72o 4 мин

Амплификация последовательности гена РНК-лигазы фага Т4

Олигонуклеотиды:

В11(к 5'-области гена)5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'

B12(к 3'-области гена) 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'

Температурный режим:

) Денатурация 95o 5 мин

) Денатурация 95o 30 сек

) Отжиг праймеров 55o 30 сек

) Элонгация 72o 2 мин 20 сек

) Повторение цикла (пункты 2-4) 24 раза

) финальная элонгация 72o 4 мин.

Амплификация последовательности гена Тth-полимеразы

Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:

А9 (к 5/-концу ) 5/- GCCGGTCTCCCATG

GAGGCGATGCTTCCG-3/

А8 (к 3/-концу) 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/

Программа:

) Денатурация 95o 5 мин.

) Денатурация 95o 30 сек.

) Отжиг праймеров 75o 30 сек.

) Элонгация 72o 2 мин 40 ceк.

) повторение цикла (пункты 6-8) 34 раза

) финальная элонгация 72o 4 мин.

клонирование эндонуклеаз рестрикция фаг

Copyright © 2013 - Все права защищены