Интерференция РНК
Одним из наиболее важных механизмов регуляции экспрессии генов является интерференция РНК. Регуляция экспрессии эукариотических генов может осуществляться на нескольких уровнях: во время транскрипции, на стадии процессинга РНК, при трансляции и на уровне созревания белка. В последнее время в связи с открытием явления интерференции РНК большое внимание ученых привлекает посттранскрипционный уровень регуляции.
Интерференция РНК - высокоспецифичный механизм подавления экспрессии гена на посттранскрипционном уровне за счет деградации считанной с него мРНК. Деградация мРНК происходит в результате комплементарного связывания комплексов, содержащих малые интерферирующие РНК (siРНК), которые относятся к семейству малых РНК, и белки, в том числе эндонуклеазы. Малые РНК - регуляторные некодирующие РНК размером от 19 до 28 н., образующиеся в клетке из более длинных двухцепочечных РНК (дцРНК). Малые РНК могут регулировать экспрессию генов не только посредством интерференции, но также подавляя трансляцию, транскрипцию или способствуя удалению гена-мишени из клеточного генома. Последнее наблюдается у некоторых простейших в процессе созревания макронуклеуса. Феномен интерференции РНК обнаружен у различных эукариотических организмов, в частности, у одноклеточных, низших грибов, растений, нематод, насекомых, а также у позвоночных, включая мышей и человека. Подобная высокая консервативность механизма интерференции РНК свидетельствует о его большой значимости. И хотя функции некоторых видов малых РНК до сих пор не установлены, предполагают, что основная их роль - защита генома клетки от внедрения мобильных генетических элементов (вирусов, транспозонов), а также участие в регуляции дифференцировки многоклеточных организмов.
Малые РНК представляют значительный интерес для фундаментальной молекулярной биологии и таких прикладных ее областей, как биомедицина и биотехнология. Одним из наиболее эффективных способов изучения функции гена является анализ фенотипа организмов, у которых этот ген не экспрессируется. Существует ряд методов, позволяющих подавлять экспрессию определенных генов, в том числе, использование антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, химических блокаторов, а также разрушение нужного гена во всем организме путем внесения соответствующих мутаций в зиготу. Однако эти методики либо сложны, либо не всегда эффективны и не обеспечивают полного сайленсинга гена (т.е. подавления экспрессии) в экспериментальных моделях млекопитающих. В отличие от перечисленных методик, технологии, основанные на явлении интерференции РНК (деградация мРНК при введении в клетку соответствующих им 81РНК или экспрессирующих их конструкций), просты в исполнении, эффективны и обладают большой специфичностью распознавания молекулы-мишени.
Выделяют два основных типа малых регуляторных РНК: малые интерферирующие РНК (siРНК) и микроРНК (miРНК). Биохимически и функционально это молекулы практически неразличимы, и принцип их подразделения основан на природе предшественников.
siРНК - малые дцРНК длиной 19-25 п.н. образуются из длинных дцРНК.
miРНК - малые оцРНК длиной 18-24 н. образуются из внутримолекулярных двухцепочечных структур (шпилек) РНК-предшественниц, транскрибируемых с генов, содержащих повторяющиеся инвертированные последовательности (палиндромы).
По происхождению малые РНК можно разделить на экзогенные (индуцируемые или кодируемые вирусами, либо введенные искусственно) и эндогенные (образующиеся при транскрипции собственных генов клетки).
Сигналом для инициации интерференции РНК служит появление в клетке экзогенной (вирусной или введенной в ходе эксперимента) либо эндогенной (транскрибированной с собственных генов клетки) дцРНК. Эффективность интерференции РНК прямо зависит от длины молекулы дцРНК: чем длиннее дцРНК, тем больше siРНК образуется, и тем большее число сайтов-мишеней на молекуле мРНК будет распознано. Минимальный размер дцРНК, достаточный для индукции интерференции, - 26 п.н. Скорее всего, такое ограничение защищает от деградации собственную клеточную мРНК с короткими внутримолекулярными самокомплементарными структурами. дцРНК распознается и нарезается ферментом Dicer. Молекула Dicer содержит N-концевой хеликазный домен - РАZ, функция которого не совсем ясна, парные РНКазные домены, а также расположенный на С-конце домен, необходимый для распознавания и связывания дцРНК. Предполагают, что расщепление дцРНК у млекопитающих осуществляется последовательно с одного конца молекулы. При этом происходит АТР-зависимая транслокация Dicer вдоль молекулы дцРНК.
В результате работы Dicer образуются двухцепочечные siРНК длиной 20-25 п.н. (видоспецифический признак). Эти молекулы содержат гидроксильные группы на З'-концах и фосфатные на 5'-концах, а также по два выступающих неспаренных нуклеотида на З'-концах. Именно такая структура необходима для участия в последующих этапах процесса, приводящего к сайленсингу РНК. Молекулы с тупыми концами или с модификацией в 5'-концевой области активностью siРНК не обладают.