Механизм обратной транскрипции
. РНКаза Н, специфичная к РНК в составе гибридного РНК-ДНК дуплекса, расщепляет сегмент РНК этого дуплекса. В результате (-) «strong-stop» (RU5) оказывается в однонитевой форме и может взаимодействовать с З'-концом (с участком R) той же самой или другой молекулы вирусной РНК, поскольку на З'-конце РНК имеется повтор R
. Новосинтезированная короткая цепь ДНК вместе с праймером «перепрыгивает» на З'-конец матрицы и взаимодействует там с комплементарным ей участком К.
. Цепь ДНК удлиняется, в качестве матрицы используется остальная часть вирусной РНК. На этой стадии в качестве затравки выступает уже (-)«strong-stop» ДНК; элонгация затравки приводит к синтезу (-) цепи ДНК, в которой отсутствует комплемент района RU5, поскольку соответствующий участок (+) матрицы был разрушен РНКазой Н.
. К моменту завершения синтеза первой цепи ДНК большая часть вирусной РНК разрушается РНКазой Н.
. Синтез З'-конца второй цепи ДНК.
. Удаление тРНК и оставшегося участка вирусной (+) РНК РНКазой Н.
. Второй прыжок, в результате которого новосинтезированная вторая цепь ДНК комплементарно взаимодействует с тРНК-связывающей последовательностью первой цепи.
. Удлинение З'-концов каждой цепи, образование дуплекса ДНК.
Вся последовательность реакций протекает без явного участия ферментов репликации клетки-хозяина (топоизомеразы, хеликазы, праймазы, ДНК-связывающего белка, лигазы и т.д.). При этом следует отметить, что молекулы вирусных ДНК длиннее молекул вирусных РНК, которые послужили матрицей для обратной транскрипции. Действительно, к 5'-концу (+) цепи вирусной ДНК добавилась последовательность U3, а к 3 -концу этой цепи - последовательность U5. В результате на концах молекулы вирус специфической ДНК появился длинный (несколько сотен нуклеотидов) концевой повтор (ДКП или LTR.), имеющий структуру U3U5.
Рис.2. Схема обратной транскрипции ретровирусной РНК с образованием двуцепочечной ДНК (Darnell J., et.al. Molecular Cell Biology. - N. Y.: Scientific Amer. Books, 1986. - P. 1052)
Синтез ДНК на РНК-матрице in vitro и ревертаза используется в генетической инженерии для синтеза генов и их фрагментов, а также целенаправленного синтеза на матричных РНК комплементарных молекул ДНК (кДНК) для расшифровки первичной структуры РНК и белков.
Рис. 3. Схема получения кДНК с использованием ревертазы вируса и трех дополнительных ферментов: поли (А)-полимеразы, фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и нуклеазы S1. (Цитировано по)
Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А) - содержащих мРНК используют олигo (dT)-праймер, а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, - химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. сoli (остающаяся часть молекулы, которая сохраняет присущие ей каталитические активности).
Уже одно это открытие формально поставило РНК в центр основного постулата молекулярной генетики, так как показало, что поток генетической информации распространяется от РНК не в одном, а в двух направлениях: не только к белку, но и к ДНК. Все более глубокое проникновение в механизмы основных молекулярно-генетических процессов (репликацию, транскрипцию и трансляцию) способствовало возникновению понятия о неканонических функциях РНК, осознанию полифункциональности рибонуклеиновых кислот.