Механизм обратной транскрипции
На обратной транскрипции основано размножение ретровирусов (вирусы, у которых геномом служит не ДНК, как обычно, а РНК) и ретротранспозонов (являются транспозиционными элементами, которые не имеют вирионных частиц, и, следовательно, в отличие от ретровирусов, не могут независимо «переносить себя» между клетками), образование так называемых ретропсевдогенов (или процессированные псевдогены это ретропоследовательности, которые потеряли свою функцию, они несут все признаки функциональных ретропоследовательностей, но имеют молекулярные дефекты, которые не дают им экспрессироваться) и достройка кончиков хромосом (теломер), укорачивающихся при каждом клеточном делении. Если молекула ДНК повреждена - например, подверглась разрыву (double-strand break, DSB) - для ее починки необходима матрица, в которой последовательность нуклеотидов соответствует исходному, «правильному» состоянию поврежденного участка. Ранее считалось, что в качестве таких матриц всегда используются другие молекулы ДНК. Позже было установлено, что иногда эти ДНК-матрицы синтезируются путем обратной транскрипции на основе РНК при участии ретротранспозонов.
При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.
Каждый вирион (полноценная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки) ретровирусов содержит две идентичные цепи РНК размером от 8000 до 10 000 нуклеотидов. Области 5'- и 3'-концов обеих цепей модифицированы, как у всех эукариотических мРНК (5'-кэпы, З'-полиадениловые хвосты). Вирусные РНК имеют 5 структурных элементов: 1) прямые повторы на 5'- и З'-концах РНК (R); 2) последовательность из 80 - 120 нуклеотидов, находящуюся около 5 концевого повтора (U5); 3) последовательность из 170 - 1200 нуклеотидов около З'-концевого повтора (U3); 4) последовательность из 15 20 нуклеотидов (Р), в пределах которой клеточная тРНК комплементарно взаимодействует с ретровирусной РНК, что создает праймер для синтеза первой цепи ДНК; 5) сегмент Pu, находящийся непосредственно перед повтором U3 и являющийся сайтом для праймирования второй цепи ДНК - такой сегмент одинаков у РНК всех ретровирусов определенного типа.
Этапы обратной транскрипции:
. Наращивание тРНК-праймера на матрицах U5 и R в направлении 3'→5'. Роль РНК-праймера выполняет одна из клеточных тРНК (например, триптофановая, пролиновая и т.д.). На расстоянии примерно 100 - 200 нуклеотидов от 5'-конца РНК (для каждого вируса - это величина постоянная) имеется участок, комплементарный З'-концевой последовательности молекулы тРНК, который используется в качестве затравки. Этот участок обычно обозначают как pbs (от англ.primer binding site участок связывания затравки). Обратная транскриптаза синтезирует сегмент ДНК, комплементарный 5'-концевой последовательности вирусной РНК. Этот сегмент принято называть (-) «strong-stop» ДНК, поскольку синтез ДНК после завершения копирования 5'-конца матрицы временно останавливается. (-) «strong-stop» ДНК содержит последовательности, комплементарные концевому району R и району U5. Таким образом, синтез ДНК начинается недалеко от 5'-конца матрицы и образуется короткий продукт. Но этот короткий продукт (-) «strong-stop» имеет последовательность, комплементарную также и З'-концу вирусной РНК, а как известно, для снятия ДНК-копии с З'-конца матрицы всегда требуется праймер. У ретровирусов комплемент З'-конца матрицы производится в «удобном» месте, а затем переносится на «свое» место. Это происходит следующим образом: 5'-конец вирусной РНК, образующий дуплекс с (-) «strong-stop» ДНК, разрушается под влиянием присущей обратной транскриптазе активности РНКазы Н.