Материалы

В работе использовались следующие реактивы: NaCl, KCl(о.с.ч ) , MgCl2, HClO4, KH2PO4, K2HPO4, NaOH, Трис-основание (Serva, Германия), БСА, ДТТ, АТФ (Sigma, США), ЭДТА (о.с.ч), бромид этидия (Serva, Германия), агароза (Bio-Rad, США), легкоплавкая агароза (Sigma, США), бактопептон, бактотриптон, глицерин, ацетат натрия, (NH4)2SO4, полиимин Р (BRL, США), фенилметилсульфонилфторид, дрожжевой экстракт (Difco, США), дезоксинуклеотидтрифосфаты (Sigma,США), [α-32P]ATP, желатина, гуанидинтиоционат (Fluka), изопропил β-D-тиогалактозид (IPTG), "стеклянное молочко"-silica (Merc, Германия), фенол, этанол,хлороформ, изопропанол, имидазол, NiSO4.

Реактивы для белкового электрофореза: акриламид, N,N'метилен-бисакриламид, персульфат аммония (Reanal, Венгрия),ТЕМЕД, Кумасси G250 (Serva, Германия), β-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия (SDS).

Белки и ферменты: сайт-специфические эндонуклеазы BspIS4 I, Xho I, Nco I, Nsi I, Sph I, BspLu11 II, Bli736 I, Paq I, термостабильные ДНК-полимеразы Taq и Pfu, лизоцим, ДНК-лигаза фага Т4

Препараты ДНК: ДНК бактериофага Т4 (частично глюкозилированная), в качестве вектора для клонирования использовали плазмиды pET-21d и pET-28b

Штамм E.coli BL21DE3: F- ompT[Ion] hsdSB (rB-mB-, E.coli B штамм, λ профаг, несущий ген Т7 РНК-полимеразы.

В работе использовались центрифуги: "Eppendorf", "Janetzki K23", прибор для проведения ПЦР "Mastercycler gradient" (Eppendorf).

Для проведения электрофорезов использовались: источники питания ИПФ-1, ИПФ-2; аппараты для электрофореза, изготовленные в мастерских Института Белка РАН.

Для выделения ДНК из легкоплавкой агарозы использовались стеклянный фильтр Glass microfibre paper (GMP) (Whatman, Англия), 60% спирт (100mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.5, 1mM ЭДТА).

Бактериальные жидкие среды:

LB: 1% бакто-триптон (Difco, США), 0.5% дрожжевой экстракт (Difco, США), 1% NaCl, pH 7.0;

SOC-среда: 2% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт, pH 7.0, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM глюкозы.

Буферные растворы:

Буфер К (для приготовления компетентных клеток): 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 70 mM CaCl2, 50 mM MgCl2.

Среднесолевой буфер MRB: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 1 мг/мл.желатина

Высокосолевой буфер HRB: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 1мг/мл желатина.

LIGB буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 50 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 10 мМ MgCl2, 10mM DTT, 1мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА.

TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ЭДТА: 89 mM Tris-борат, 2 mM ЭДТА.

Х TermoPol буфер для Taq- и Pfu-ДНК-полимераз: 10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl ( pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100.

Хроматографические носители:

Фенил-сефароза, гепарин-сефароза, голубая агароза (Институт химии, Таллин), Ni2+-NTA-агароза.

Антибиотики: ампициллин, канамицин.

Олигонуклеотиды:

F1 5/-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

F2 5/-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'

С8 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG-3'

С5 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'

В11 5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'

B12 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'

А9 5/- GCCGGTCTCCCATGGAGGCGATGCTTCCG-3/

А8 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/

Олигонуклеотиды синтезированы фирмой "СИНТОЛ", г. Москва.

Методы