РНК-лигаза фага Т4
Применение РНК-лигазы фага Т4
1) РНК-лигаза широко используется для синтеза олигорибонуклеотидов заданной последовательности оснований [31, 42]. При этом в качестве доноров используются олигонуклеотиды с блокированными 3/-концами, т. к. олигомеры с длиной больше, чем 8 оснований, могут участвовать во внутримолекулярной реакции, образуя циклические соединения . Разрешение проблемы -использование 3/-фосфорилированного донора или химическая модификация 2/- или 3/-гидроксильной группы концевого нуклеотида донора [42].
2) Способность РНК-лигазы соединять одноцепочечные молекулы ДНК может использоваться для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов [43].
3) С помощью РНК-лигазы можно производить радиоактивное мечение 3/-концов молекул РНК. В реакции используется [5/-32P]pNp в качестве донора и РНК как акцептор. Эта реакция получается аналогичной мечению 5/-конца цепи РНК in vitro с помощью полинуклеотидкиназы и [γ32P]ATФ, и может быть использована в ситуации, когда 5/-концевое мечение невозможно [44].
4) Получение модифицированных нуклеиновых кислот при использовании модифицированных pNp [31,44].
5) Разработан метод амплификации фрагментов ДНК, содержащих последовательность определенного гена и примыкающую к нему 5/-некодирующую область (так называемый "заякоренный ПЦР"- anchored PCR). В данном случае делают ПЦР с геномной ДНК или кДНК с использованием одного специфического праймера (А) к 3/-концу определенного гена. К 3/-концу одноцепочечного продукта реакции (последовательность этого конца неизвестна) "пришивается" лигируется олигонуклеотид В (с любой выбранной последовательностью нуклеотидов) с помощью Т4 РНК-лигазы (рис. 4). Затем для получения двухцепочечного фрагмента проводится ПЦР с использованием праймеров А и С ( С комплементарен праймеру В) . Далее можно лигировать полученный фрагмент с вектором [45].
2. Экспериментальная часть