РНК-лигаза фага Т4
Т4 РНК-лигаза была открыта в 1972 году в лаборатории of Hurwitz. Фермент был обнаружен как активность, катализирующая циклизацию гомополирибонуклеотидов с 3/-концевым гидроксилом и 5/-концевым фосфатом с образованием 3/-5/ фосфодиэфирной связи [30]. РНК-лигаза (ЕС 6.5.1.3) продуцируется клетками E. coli, зараженными фагом Т4. Фермент катализирует АТФ-зависимое внутри- и межмолекулярное образование фосфодиэфирной связи между 5/-фосфат и 3/-гидроксильным концами РНК. Реакция сопровождается гидролизом АТФ до АМФ и пирофосфата. [31,32,33]. Фермент может осуществлять межмолекулярную реакцию как с РНК, так и с ДНК. В 1977 году было показано, что РНК-лигаза является продуктом гена 63 (gp63) фага Т4 и что этот же фермент осуществляет присоединение хвостового отростка к базальной пластине фага [31,34].
Физические свойства РНК-лигазы
Молекулярная масса фермента по данным SDS-электрофореза колеблется от 41 до 45 кДа. В неденатурирующих условиях масса составляет 47 кДа по результатам гель фильтрации и 48,2 кДа по данным седиментационного ультрацентрифугирования.
Изоэлектрическая точка для фермента 6,1. Поглощение раствора белка при концентрации 1 мг/мл и длине волны 280 нм составляет 1,3 [31].
Реакции, осуществляемые РНК-лигазой.
(1) Е + АТФ « Е-рА + РРi
(2) Е-рА + рNn « Е [A5/ pp5/ Nn]
(3) Е [A5/ pp5/ Nn] + Mm « MmpNn + AMФ + Е
А. Прямая межмолекулярная реакция.
Рисунок 3 Показывает механизм прямой межмолекулярной реакции. Олигорибонкулеотид А3 с 3/-ОН концом (называемый акцептором) присоединяется к 5/-фосфорилированному донору рСр. Изучение субстратной специфичности фермента позволило сделать вывод, что в РНК-лигазе содержится как минимум 3 сайта, связывающих нуклеотиды. Первый сайт связывает АТФ, второй связывает акцептор, содержащий реактивный 3/-гидроксил и третий связывает донор, несущий 5/-фосфат для связывания с акцептором.
Cубстрат-связывающие сайты фермента имеют разную специфичность.
Донорный сайт связывает остаток нуклеозида и его две ассоциированных фосфатных группы с наименьшей специфичностью к нуклеозиду.
Акцепторный сайт связывает 3 нуклеозида и 2 фосфата. При этом выявляется сильное предпочтение к рибонуклеозидам, в сравнении с дезоксирибонуклеозидами.
АТФ-связывающий сайт высоко специфичен относительно аденозиновой части молекулы АТФ[31].
1) Аденилирование фермента с АТФ с освобождением пирофосфата- первое событие, происходящее в процессе образования фосфодиэфирной связи. Эта реакция может происходить в отсутствии донора и акцептора. Аденилированный фермент может освобождаться в присутствии пирофосфата с восстановлением АТФ. Аденилированный фермент можно отделить от свободного с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [31,34]. Один моль АТФ связывается с одним моль фермента.
2) Образование аденилированного донора. Адениловая-группа переносится с фермента на 5/-фосфат донора. Образование 5/→5/ ангидридной связи активирует 5/-фосфат донора для последующей реакции. Образование активированного донора стимулируется присутствием акцептора.
Акцептор является не только субстратом в реакции, но и кофактором для аденилирования молекулы донора. В отсутствии 3/-OH группы активированный промежуточный продукт не образуется [35] Стимулирование акцептором переноса аденила с фермента на донор может служить для согласованной реакции, чтобы убедиться, что акцептор находится на поверхности фермента, когда донор активируется. Но, когда в реакции мало акцепторов, активированный донор может диссоциировать с фермента [36,37,38].
Субстратная специфичность по отношению к молекуле донора в реакции аденилирования может быть определена невпрямую, а по всей реакции соединения. Рибонуклеозид 3/-5/-бифосфат может служить субстратом, тогда как 5/-нуклеозид монофосфат- нет, даже если последний имеет 5/-фосфат. Таким образом, по крайней мере остаток из одного нуклеотида и 3/-фосфат необходимы для того, чтобы служить донором. Второй фосфат должен быть на 3/-гидроксильном конце, т. к. рибонуклеозид 2/,5/-бифосфат не участвует в реакции. Сайт связывания донора, возможно, не выходит за пределы начального 5/-pNp района донора, т. к. скорость реакции с серией гомологичных доноров pAnp c одним и тем же акцептором почти одинакова.