Полинуклеотидкиназа фага Т4
Функция полинуклеотидкиназы в клетках млекопитающих остается неясной. Возможно, она играет особенную роль в репарации поврежденной ДНК в кооперации с полинуклеотид лигазой [24].
Использование полинуклеотидкиназы фага Т4
1) Киназная и фосфатазная активности фермента при желании могут быть использованы независимо. При инкубации в отсутствии АТФ 3/-фосфат можно убрать с ДНК или РНК без разрушения 5/-фосфата. Если олигонуклеотид с 3/-фосфатом инкубировать в присутствии фермента и АТФ при рН 9,0 (или выше) ограниченное время, то 5/-фосфат может быть введен не затрагивая основной массы 3/-фосфатов [22].
) 5/-концевой гидроксил полинуклеотида может быть мечен как с помощью прямой реакции, так и с помощью реакции обмена, которую фермент катализирует в присутствии [γ-32P]АТФ и АДФ [26]:
5/-ОН-конец + АТФ ↔ 5/-Фосфат-конец + АДФ
Таким образом можно использовать обратную реакцию для прямого мечения 5/-фосфорилированных концов двухцепочечных нуклеиновых кислот избегая предварительного дефосфорилирования [27].
Киназную реакцию можно ускорить (улучшить) добавлением ПЭГ, что может обеспечить более эффективную реакцию при очень низких концентрациях субстрата [26].
) Разработан быстрый и количественный метод измерения активности эндонуклеаз рестрикции второго класса. Он позволяет количественно определить число сайтов разрезания эндонуклеазой на молекуле ДНК. Число образуемых фрагментов в молях может быть определено по количеству включенной в нуклеотидную цепь радиоактивности, т. к. величина введенной метки 32Р пропорциональна числу образующихся концов ДНК и не зависит от количества нуклеотидов в ней [28, 29].